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轉染試劑配方

來源: 發布時間:2021-09-14

原代細胞直接分離自組織并在適當條件下增殖,因此,它們的形態學和生理特征和體內狀態更為相似。但相對于連續細胞系,它們通常更難培養和轉染。在經過***次傳代培養之后,原代培養物變成了一種細胞系。源自于原代培養物的細胞系具有有限的壽命(即它們是有限細胞系),且隨著傳代的進行,具有比較高的生長能力的細胞逐漸占據支配地位,從而造成了細胞群內的基因型和表型接近一致的情形。相對來說,這一類細胞要比原代細胞使用起來更為方便,尤其是穩定轉染的克隆傳代。轉染產品知多少——siRNA轉染試劑.轉染試劑配方

轉染是將外源核酸導入真核細胞的過程,是細胞和分子生物學研究的重要工具,也是大部分的生物和分子生物領域的科研黨們繞不開的話題。然而常常聽到的抱怨是"轉染效率太低""轉染完細胞全漂了""轉染后忘記給細胞換液了",真所謂辛辛苦苦實驗N多回,一夜回到解放前……眾所周知,影響轉染成功的因素非常多,包括細胞質量、核酸質量、微生物污染、轉染試劑等。各種細胞使用的轉染條件都可能不同,現實中也并沒有一種放之四海而皆準的方案。北京pei轉染試劑與lipo2000研發合成的針對siRNA、microRNA、mimic、inhibitor、mRNA和shRNA等RNA的轉染試劑。

原代細胞直接分離自組織并在適當條件下增殖。因此,它們的形態學和生理特征和體內狀態更為相似。但相對于連續細胞系,它們通常更難培養和轉染。在經過***次傳代培養之后,原代培養物變成了一種細胞系。源自于原代培養物的細胞系具有有限的壽命(即它們是有限細胞系),且隨著傳代的進行,具有比較高的生長能力的細胞逐漸占據支配地位,從而造成了細胞群內的基因型和表型接近一致的情形。相對來說,這一類細胞要比原代細胞使用起來更為方便,尤其是穩定轉染的克隆傳代。

轉染 48 小時后,使用尼康熒光顯微鏡 GFP 熒光進行成像(左側四幅圖),A:LipoD293; B:293fectin;C:Xfect 和 D:Fugene 6.  帶有 6xHis 標記的 GFP 熒光蛋白使用 Ni-NTA 親和柱技術實現分離。5 微升洗脫液載入 SDS-PAGE 凝膠電泳分離并進行 Coomassie 亮藍染色(右上圖 E),道 1 為 LipoD293293、道 2 為標準蛋白分子、道 3 為 Xfect、道 4 為 293fectin 和道 5 為 Fugene 6。這四種轉染試劑產生蛋白質的效率被進一步定量(見右下圖 F)。產生慢***的比較

通過 LipoD293? 試劑(升級版)和 Lipofectamine LTX(LTX)試劑將三個 cDNAs 共轉染進 293T 細胞。一個 GFP 載體,pHR-SIN-cppt-CMVEWP 被用來測定慢***的滴度。在 24 孔板中每孔加入 1x10^5 293T 細胞,其次是分別添加不同量的慢定都上清液,1 微升(上圖)和 10 微升(下圖)。 轉染后6h觀察細胞狀態,并更換培養基,繼續培養24 h后收取細胞,用PBS洗滌3次以上,以備RNA抽提。

確定希望輸送的運載物

(如DNA、RNA或蛋白質)

根據不同實驗類型,我們可能需要將不同的運載物輸送到細胞內部,包括**常見的DNA,用于基因編輯的siRNA,能夠更快表達蛋白的mRNA,CRISPR-Cas9甚至是體內轉染。正確的了解您希望輸送的運載物是選擇可靠轉染產品的第一步。

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希望轉染的細胞類型

轉染的細胞類型可簡單分為兩大類,連續細胞系和原代細胞。

連續細胞系具有無限增殖的潛能,通常要比原代或有限細胞更易處理。但由于此類細胞經歷過基因改變而變得具有無限增殖能力,它們在培養過程中的表現可能無法必然地反映體內狀態。 從而造成了細胞群內的基因型和表型接近一致的情形。黑龍江轉染試劑配制步驟

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在難轉染細胞(原代大鼠動脈平滑肌細胞)轉染效率的比較

圖片由芝加哥大學肺和重癥護理系的 Nickolai Dulin 博士友情提供

制備大鼠的動脈平滑肌原代細胞并用使用 LipoD293?試劑(左圖)和 Lipofecatmine 2000(L2K, 右圖)分別將 GFP 的 cDNA(pEGFP-N3)按照生產制造商的轉染操作步轉染至該細胞。轉染 24 小時后,用尼康 Eclipse 2000 熒光顯微鏡檢測 GFP 熒光,以此來評價轉染效率。

對難轉染細胞 LNCap 細胞轉染效率的比較

圖片由羅斯威爾公園**研究所(Roswell Cancer Institute)的 Lyn Gao 博士友情提供



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