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杭州mRNA-seq轉錄組學研究方法

來源: 發布時間:2022-01-23

單細胞轉錄組學技術:單細胞轉錄組目前主要有三種方法:SMART擴增技術、10×genomics技術及Andeplete技術。SMART擴增技術比較關鍵的技術,就是設計了2個特殊的引物。再配合用MMLV逆轉錄酶進行逆轉錄。特殊引物1由中間PolyT序列加上一段通用序列及3’末端兩個簡并堿基構成,但在PolyT的3’端倒數第二個堿基是A、C、G而非T的簡并堿基,而倒數第1個為簡并堿基,這樣做的好處是讓它正好結合在mRNA的3’端連到Poly(A)尾巴的這個連接處,而不會結合到mRNA的別的地方。這樣就保證了逆轉錄的起始位置正好是mRNA的3’端的序列終止位置。MMLV逆轉錄酶,這個酶有個特點,就是它在轉錄到mRNA的5’端末端的時侯,會在新合成的cDNA的3’末端,多加出幾個C堿基來。轉錄組具有時間特異性的特點。杭州mRNA-seq轉錄組學研究方法

RNA-Seq,是基于新一代測序技術的轉錄組學研究方法:首先提取生物樣品的全部轉錄的RNA并進行mRNA富集,然后反轉錄為cDNA后進行的新一代高通量測序,在此基礎上進行片段的拼接組裝,從而可得到一個個的轉錄本,進而可以形成對該生物樣品當前發育狀態的基因表達狀況的全局了解。不同階段或部位的生物樣品的RNA-Seq轉錄組進行比較分析,則可以在轉錄層面得到基因表達水平的變化,針對關鍵基因則可以進行代謝通路(Pathway)的構建。轉錄組學即特定細胞在某一功能狀態下轉錄出來的所有RNA的總和,包括mRNA和非編碼RNA。貴州高通量轉錄組學質譜鑒定普通轉錄組測序主要適用于不同的生長階段或者發育過程。

轉錄組學的概念:轉錄組是指特定組織或細胞在某一發育階段或功能狀態下轉錄出來的所有RNA的匯合,包括蛋白質編碼的信使RNA和非編碼RNA(rRNA、tRNA和其他ncRNAs),高通量測序技術也被稱為下一代測序(NGS)技術,推進了基因組學的研究進展。該項新技術除了研究靜態基因組,近年來也開始應用于動態轉錄分析,由此衍生的技術稱為RNA序列分析(RNA-seq)隨著DNA基因芯片技術的快速發展,開創了這個病癥近十年的高通量轉錄組研究。RNA-Seq技術可以從轉錄水平檢測瘤中的改變基因。通過相關軟件分析,鑒定相關改變基因在瘤發生的發展中所起的作用。然后經過刷選,進一步挑選出相關靶基因進行實驗研究,有望為瘤的基因醫治提供新的靶點。

宏轉錄學組概念:宏轉錄組測序是對某一特定時期、特定環境樣品中的全部微生物的RNA進行高通量測序,直接獲得該環境中所有微生物轉錄組信息的一種測序技術的新應用。宏轉錄組中不只包含有微生物的物種信息,還有微生物的基因表達信息。如果說宏基因組能告訴我們微生物群,那么宏轉錄組則能告訴我們這些微生物,這有助于挖掘微生物功能基因和探索微生物與環境、疾病、動植物等關系的機制。宏轉錄組分析:從以G為單位的高通量測序數據中獲取研究所需的微生物種類、基因、通路等信息是進行宏轉錄組研究必須經歷的一步。現在網絡上分析組學數據的工具五花八門。能否從眾多組學工具中選擇出適合分析宏轉錄組數據的軟件,能否搭建一套完整、快速、高效、靈敏、高精確的宏轉錄組分析pipline,直接關乎到后期數據分析的進行。轉錄組學包括:mRNA、ncRNA、rRNA等。

全轉錄組學測序技術優勢:文庫優化:針對不同長度的序列采用兩種文庫構建方法,采用去核糖體的鏈特異性文庫可以獲得mRNA、lncRNA和circRNA的序列信息。數據全:全轉錄組測序完成后可獲取4類主要RNA(miRNA,mRNA,lncRNA,circRNA)數據,可對這些數據進行標準分析及整合分析。關聯全:通過對mRNA/miRNA/lncRNA/circRN序列測定及后續分析,深入開展全轉錄組調控網絡(ceRNA網絡)分析。樣本類型:細胞,組織,體液、血清、血漿、全血,總RNA等。建議總RNA起始量:>15μg,濃度≥200ng/μL)。轉錄組學可應用于炎癥發生機制的發現及干預。杭州mRNA-seq轉錄組學研究方法

轉錄組學是從RNA水平研究基因表達的情況。杭州mRNA-seq轉錄組學研究方法

單細胞轉錄組學基本概念:普通轉錄組的思路也可以應用到單細胞轉錄組。普通轉錄組相當于把一群細胞混合到一起去提取RNA,獲得的是每個細胞中RNA表達量的平均值。單細胞是把每個細胞單獨分出來去提取RNA,然后建庫測序,獲得是是單個細胞的表達值。在每個細胞里面基因的表達具有隨機性,且存在異質性。而且這些細胞群中會存在不同類型的細胞,尤其是當我們對整個組織進行測序時,它們本身就是由不同類型的細胞組成的,而我們用普通轉錄組來測序,相當于掩蓋住了這些不同的細胞類型的差異,展示的是整個組織的平均的狀態,所以說單細胞從這個來看跟普通轉錄組就不同在是用一個細胞測,不是用一堆細胞測。杭州mRNA-seq轉錄組學研究方法

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