耐藥基因表達(dá)的研究：目前研究中發(fā)現(xiàn)主要的

耐藥機(jī)制有：ATP結(jié)合盒基因超家族的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)

的耐藥，這些蛋白包括：MDR-1基因編碼的P-糖蛋白，

多藥耐藥相關(guān)蛋白，肺耐藥相關(guān)蛋白，乳腺耐藥蛋

白等；酶介導(dǎo)的耐藥，包括拓?fù)鋵?dǎo)構(gòu)酶，谷胱甘肽及谷

胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶，蛋白激酶C，脫氧胞嘧啶核苷激酶等，

凋亡基因介導(dǎo)的耐藥，如bcl-2家族，p53基因，c-myc

等。多藥耐藥是多因素，多種機(jī)制共同作用的結(jié)果。

real-time反轉(zhuǎn)錄 PCR是了解耐藥指導(dǎo)臨床策

略的有用手段，它能觀測(cè)用藥前后及復(fù)發(fā)時(shí)細(xì)胞的

耐藥基因mRNA表達(dá)變化，從而及時(shí)調(diào)整方案和評(píng)

價(jià)疾病的預(yù)后 qPCR的主要特點(diǎn)有很多。內(nèi)蒙古TaqMan熒光探針qPCR機(jī)構(gòu)哪家好

實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 中的 3 個(gè)概念，即基線、閾值與 CT

值是理解其原理的關(guān)鍵。在線性圖譜中，基線體現(xiàn)在與 X 軸

平行的部分，對(duì)數(shù)圖譜中，它體現(xiàn)在背景信號(hào)雜亂的部分，系

統(tǒng)會(huì)自動(dòng)形成基線的起始循環(huán)數(shù)與終止循環(huán)數(shù)，也可手動(dòng)

調(diào)節(jié)。熒光閾值指的是熒光強(qiáng)度值，將它界定為 3~15 個(gè)循

環(huán)的熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)差的 10 倍[2]，在擴(kuò)增曲線里，穿過(guò)閾值與

X 軸形成的平行線即為閾值線，系統(tǒng)可自動(dòng)形成也可手動(dòng)

設(shè)置，手動(dòng)設(shè)定閾值時(shí)，在指數(shù)增長(zhǎng)期內(nèi)重復(fù)性好的范圍內(nèi) 內(nèi)蒙古TaqMan熒光探針qPCR機(jī)構(gòu)哪家好用qPCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)mRNA的表達(dá)量。

因此大量有關(guān)qPCR發(fā)表的文獻(xiàn)中存在結(jié)果證據(jù)不足甚至是相互矛盾的結(jié)果，這對(duì)科學(xué)研究是一個(gè)很大的危險(xiǎn)。科學(xué)文獻(xiàn)的發(fā)表和撤回也為人們提出了警示。多數(shù)研究報(bào)告缺少足夠的信息加劇了這個(gè)問(wèn)題，使用qPCR的文獻(xiàn)沒有提供足夠的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)，可以讓讀者評(píng)估結(jié)果的質(zhì)量或者重復(fù)實(shí)驗(yàn)。具體表現(xiàn)為樣本的采集和處理信息，RNA質(zhì)量和完整性，反向轉(zhuǎn)錄細(xì)節(jié)，PCR效率，以及分析參數(shù)等等，這些信息常常被忽略，然而樣本正規(guī)化是反對(duì)沒有價(jià)值的單一參考基因。

定量方法：在real-time Q-PCR中，模板定量有兩

種策略；相對(duì)定量和 Absolute Quantitation。相對(duì)定量指的是在

一定樣本中靶序列相對(duì)于另一參照樣本的量的變化。絕

對(duì)定量指的是用已知的標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)推算未知的樣本的

量。標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對(duì)定量：由于在此方法中量的表

達(dá)是相對(duì)于某個(gè)參照物的量而言的，因此相對(duì)定量的標(biāo)

準(zhǔn)曲線就比較容易制備，對(duì)于所用的標(biāo)準(zhǔn)品只要知道其

相對(duì)稀釋度即可。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，樣本的靶序列的量來(lái)

自于標(biāo)準(zhǔn)曲線，終必須除以參照物的量，即參照物是

1×的樣本，其他的樣本為參照物量的n倍。在實(shí)驗(yàn)中為

了標(biāo)準(zhǔn)化加入反應(yīng)體系的RNA 或DNA的量，往往在反

應(yīng)中同時(shí)擴(kuò)增一內(nèi)源控制物，如在基因表達(dá)研究中，內(nèi)

源控制物常為一些管家基因(如beta- actin，3-磷酸甘油

醛脫氫酶 ***DH等)。 qPCR的主要特點(diǎn)都有哪些呢？

當(dāng)初始模板核酸濃度≤1 copies/μL 時(shí)，這時(shí)的影響因素不光是你能否檢測(cè)到，還取決于你每次能取到模板的概率。因?yàn)樵诘蜐舛认?，每次取到模板的概率是服從泊松分布的。不明白的可以看看（診斷試劑評(píng)價(jià)系列 4 - 比較低檢測(cè)限，你做對(duì)了嗎？）qPCR循環(huán)數(shù)試驗(yàn)：模板濃度：將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋為0.5，1，2，3，4，5copies/μL，模板上樣量2μL，每個(gè)濃度10次重復(fù)。擴(kuò)增體系：使用相同的引物探針和擴(kuò)增體系進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增體系體積為20μL。該擴(kuò)增體系的R^2=0.997,E=92.57%,斜率-3.51。循環(huán)數(shù)：分別進(jìn)行40個(gè)循環(huán)和45個(gè)循環(huán)，其他條件完全一致。RT-qPCR 的 Ct 值偏大主要有兩種情況，一種是所有基因 Ct 都偏大，另外一種是個(gè)別基因 Ct 偏大。重慶TaqMan熒光探針qPCR實(shí)驗(yàn)

qPCR的好處您了解多少呢？?jī)?nèi)蒙古TaqMan熒光探針qPCR機(jī)構(gòu)哪家好

Ct值能否直接換算成模板拷貝數(shù)？通過(guò)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（E：90%~110%，R^2≥0.99，斜率-3.58~-3.10）的方法可以獲得未知樣品的初始模板拷貝數(shù)，前提是需要樣品與標(biāo)準(zhǔn)品同時(shí)擴(kuò)增，定量標(biāo)準(zhǔn)品需要使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)等定量準(zhǔn)確的物質(zhì)（OD260/280換算的的拷貝數(shù)誤差很大），即使如此定值結(jié)果仍存在一定的誤差。熒光定量PCR是否為定量方法？雖然名字里有「定量」，但是qPCR的間接定量方式又復(fù)雜，又受很多因素影響，又不準(zhǔn)確，在計(jì)量領(lǐng)域是不被認(rèn)可的。目前的核酸檢測(cè)方法中只有數(shù)字PCR是真正的定量檢測(cè)方法，其余的都是定性檢測(cè)方法。內(nèi)蒙古TaqMan熒光探針qPCR機(jī)構(gòu)哪家好